凯氏定氮法

　　蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 公卫考场

　　1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 公卫家园

　　反应式为：

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　　2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂） 公卫考场

　　2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 公卫百科

　　反应式为:

　　(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 公卫人

　　2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 公卫百科

　　3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量 公卫百科

　　反应式为：

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　　(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3

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　　(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 公卫家园

　所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

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　　2.1 硫酸铜。

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　　2.2 硫酸钾。 公卫考场

　　2.3 硫酸。

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　　2.4 2%硼酸溶液。 公卫论坛

　　2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 公卫百科

　　2.6 40%氢氧化钠溶液。

　　2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。

1.安全管 公卫人

　　2.导管 公卫论坛

　　3.汽水分离管 公卫百科

　　4.样品入口 公卫家园

　　5.塞子 公卫论坛

　　6.冷凝管 公卫人

　　7.吸收瓶

　　8.隔热液套 公卫百科

　　9.反应管 公卫人

　　10.蒸汽发生瓶

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1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

　　2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 公卫论坛

　　3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。

　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。 公卫家园

　　X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%　 公卫考场

　　X：样品中蛋白质的百分含量，g；

　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； 公卫人

　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

　　N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 公卫考场

　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：样品的质量（体积），g（ml）； 公卫百科

　　F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

         (1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

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　　（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

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　　（3） 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。 公卫论坛

　　（4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

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　　（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 公卫考场

　　（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。 公卫人

　　（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 公卫考场

　　（8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

　　（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

　　（10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

　　（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

　　（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。

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