彗星试验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞　K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

　　1.2　紫外线照射装置　紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

　　1.3　主要试剂和仪器　培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，http://casp.sourceforge.net/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

　　1.4　实验分组及UV处理

　　收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

　　1.5　细胞活性检测　台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。

　　1.6　彗星实验　1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验，我们对该实验流程进行改良，首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，中和完成后再用梯度酒精脱水。具体流程如下：①镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.2％的常熔点琼脂糖中浸没1 min后，置37 ℃孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃)以1∶1的比例在离心管中混匀，立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶)，4 ℃静置15 min后取下盖片，制得含细胞胶层。②裂解，4 ℃，1 h。③水洗，三蒸水4 ℃水洗3 次，5 min/次。④解旋，4 ℃，20 min。⑤电泳，4 ℃，20 min，0.8 V/cm。⑥中和，3 次，每次5 min。⑦梯度酒精脱水，(50％、70％、80％、90％、100％、100％，常温下各一次，每次5 min)。⑧染色(EB，20 μg/ml，20 μl),之后镜检，每组随机取50 个细胞，用CASP分析软件进行分析[11～14]。

　　1.7　统计学方法　实验数据进行t 检验。

　　2　结　果

　　2.1　改良实验方法的结果　通过对制胶方法的改进，基本解决了实验中常见的脱胶现象。同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面上(图1)，采图更为方便、可靠。

　　2.2　台盼蓝染色　结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。

　　2.3　彗星实验结果

　　由表1可知，UV照射K562细胞从最短的照射时间(3 s，0.9 mJ/cm2)开始，实验组尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于对照组，且差异具有统计学意义 (P<0.01)。当UV照射时间延长到240 s时，各参数不再增加。从3 s到180 s，这些检测参数均表现出时间依赖效应。

　　表2的数据显示，实验组彗星头部半径、头部的面积、头部的DNA含量、头部平均荧光强度、头部DNA百分比随照射时间的增加，表现出振荡模式。

　　表3的实验结果显示，UV处理后，实验组细胞核DNA尾部的面积、尾部DNA、尾部DNA百分比均大于对照组，t检验有统计学意义(P<0.01)，且随UV照射时间的延长，除尾部平均荧光强度外，其它各参数下实验组表现出增加的趋势，显示出时间依赖效应。

　　3　讨　论

　　DNA分子中的共轭键可吸收较短波长的紫外线，从而导致自身发生损伤[15]。彗星实验可以检测DNA链断裂损伤。

　　我们采用改良的彗星实验进行检测，用尾长、彗星长、尾矩，Olive尾矩作为分析指标，结果显示，0.3mW/cm2 UV照射3 s即可造成细胞DNA损伤，且随UV照射时间的增加，DNA损伤也增加，表现出良好的时间效应关系，说明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。当照射时间增加到240 s时，各分析指标有下降的趋势，表明彗星实验有检测的阈值，当细胞损伤程度超过此值后，该方法就不能够进行准确的检测。

　　当以尾部的面积、尾部的DNA和尾部的DNA百分比作为分析指标时，结果表现出时间依赖性，提示可以将这些参数用作DNA损伤的分析指标。Durand等[16]分析了彗星图象的几种指标(尾长，彗星尾部DNA百分比，彗星尾矩)，发现尾矩这一指标具有分析范围广的特点。我们的实验结果与他们的研究有较好的一致性。

　　由于尾矩、Olive尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的DNA含量以及尾部的DNA百分比，因此选择尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩作为彗星实验的分析指标，均能较好反映细胞DNA的损伤程度。而采用彗星头部半径、头部面积、头部DNA含量、头部DNA百分比和头、尾部的平均荧光强度作为分析指标时，损伤程度随UV光强的增加表现出振荡模式，提示这6种分析指标不适合用作彗星实验DNA损伤的评价指标。综上，我们建立的改良彗星实验系统具有较好的可靠性，CASP分析软件可用于彗星实验的分析，彗星长、尾长、尾矩和Olive尾矩，均能较好地反映细胞DNA的损伤程度。