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彗星试验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1~3],并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet,UV),属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7~9],诱导K562细胞DNA损伤,用改良彗星实验检测损伤程度,验证改良的实验系统是否可靠,同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。 公卫百科


  1 材料与方法

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  1.1 细胞 K562细胞,来源于第四军医大学免疫学教研室,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,取对数期细胞进行实验。

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  1.2 紫外线照射装置 紫外消毒灯(ZSZ-20型,20 W,天津市紫晶特种光源有限公司)。

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  1.3 主要试剂和仪器 培养基:10%新生牛血清(杭州四季青公司),90% RPMI-1640培养液(Hyclone公司);双抗(青、链霉素,100 UI/ml);Triton X-100(Genview分装);二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装);低熔点琼脂糖(FMC分装);常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪:由西北大学物理系提供;电泳槽:DYC33A型(北京市六一仪器厂);显微镜:Leica DM LB 2 (Leica 公司);彗星图象分析软件:CASP软件(casp-1.2.2,http://casp.sourceforge.net/index.php下载);CO2培养箱:BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司);环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。 公卫百科

  1.4 实验分组及UV处理

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  收集对数生长的K562细胞,台盼蓝染色计数,细胞活力大于95%,用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml,接种于塑料培养皿中(ф=35 mm,2 ml/plate),然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组,各照射组分别照射3、5、10、40,60、120、180、240 s,对照组不进行紫外线照射,之后进行彗星实验。

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  1.5 细胞活性检测 台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。 公卫家园

  1.6 彗星实验 1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验,我们对该实验流程进行改良,首先改变了制胶方法,并在裂解后加入水洗的操作步骤,中和完成后再用梯度酒精脱水。具体流程如下:①镀膜法制备底胶,将洁净的载玻片在0.2%的常熔点琼脂糖中浸没1 min后,置37 ℃孵箱烘烤过夜;实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃)以1∶1的比例在离心管中混匀,立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶),4 ℃静置15 min后取下盖片,制得含细胞胶层。②裂解,4 ℃,1 h。③水洗,三蒸水4 ℃水洗3 次,5 min/次。④解旋,4 ℃,20 min。⑤电泳,4 ℃,20 min,0.8 V/cm。⑥中和,3 次,每次5 min。⑦梯度酒精脱水,(50%、70%、80%、90%、100%、100%,常温下各一次,每次5 min)。⑧染色(EB,20 μg/ml,20 μl),之后镜检,每组随机取50 个细胞,用CASP分析软件进行分析[11~14]。 公卫人

  1.7 统计学方法 实验数据进行t 检验。 公卫人


  2 结 果 公卫论坛

  2.1 改良实验方法的结果 通过对制胶方法的改进,基本解决了实验中常见的脱胶现象。同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面上(图1),采图更为方便、可靠。

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  2.2 台盼蓝染色 结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。 公卫考场

  2.3 彗星实验结果 公卫百科

  由表1可知,UV照射K562细胞从最短的照射时间(3 s,0.9 mJ/cm2)开始,实验组尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于对照组,且差异具有统计学意义 (P<0.01)。当UV照射时间延长到240 s时,各参数不再增加。从3 s到180 s,这些检测参数均表现出时间依赖效应。

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  表2的数据显示,实验组彗星头部半径、头部的面积、头部的DNA含量、头部平均荧光强度、头部DNA百分比随照射时间的增加,表现出振荡模式。

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  表3的实验结果显示,UV处理后,实验组细胞核DNA尾部的面积、尾部DNA、尾部DNA百分比均大于对照组,t检验有统计学意义(P<0.01),且随UV照射时间的延长,除尾部平均荧光强度外,其它各参数下实验组表现出增加的趋势,显示出时间依赖效应。

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  3 讨 论

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  DNA分子中的共轭键可吸收较短波长的紫外线,从而导致自身发生损伤[15]。彗星实验可以检测DNA链断裂损伤。

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  我们采用改良的彗星实验进行检测,用尾长、彗星长、尾矩,Olive尾矩作为分析指标,结果显示,0.3mW/cm2 UV照射3 s即可造成细胞DNA损伤,且随UV照射时间的增加,DNA损伤也增加,表现出良好的时间效应关系,说明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。当照射时间增加到240 s时,各分析指标有下降的趋势,表明彗星实验有检测的阈值,当细胞损伤程度超过此值后,该方法就不能够进行准确的检测。

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  当以尾部的面积、尾部的DNA和尾部的DNA百分比作为分析指标时,结果表现出时间依赖性,提示可以将这些参数用作DNA损伤的分析指标。Durand等[16]分析了彗星图象的几种指标(尾长,彗星尾部DNA百分比,彗星尾矩),发现尾矩这一指标具有分析范围广的特点。我们的实验结果与他们的研究有较好的一致性。

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  由于尾矩、Olive尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的DNA含量以及尾部的DNA百分比,因此选择尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩作为彗星实验的分析指标,均能较好反映细胞DNA的损伤程度。而采用彗星头部半径、头部面积、头部DNA含量、头部DNA百分比和头、尾部的平均荧光强度作为分析指标时,损伤程度随UV光强的增加表现出振荡模式,提示这6种分析指标不适合用作彗星实验DNA损伤的评价指标。综上,我们建立的改良彗星实验系统具有较好的可靠性,CASP分析软件可用于彗星实验的分析,彗星长、尾长、尾矩和Olive尾矩,均能较好地反映细胞DNA的损伤程度。

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