火箭免疫电泳

一、实验原理

火箭免疫电泳^[1]（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量（即反向火箭免疫电泳）。

二、实验材料

（一）材料和试剂

1、PH8.6，0.1M巴比妥--巴比妥钠缓冲液

巴比妥钠 10.3 g

巴比妥 1.84 g

硫柳汞 100 mg（防腐剂）

蒸馏水加热溶解并定容至500ml

2、1%预复琼脂（或琼脂糖）

1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。

3、1.5%琼脂糖凝胶

1.5g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。

4、抗原及相应免疫血清。

（二）设备和器材

玻璃板、模具，打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒（内铺有湿润的滤纸）、温箱（25℃）、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。

三、操作步骤

1、抗原、抗体浓度的选择

以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法，选取最小抗原量与最低抗体浓度，在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰，长达2～5cm者为标准。一般抗原用量为0.5～5微克，抗血清用量为5～10微升，稀释度于1：10～1：200之间进行选择。

2、预复琼脂玻板的制备

将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。

3、抗血清琼脂板制备

根据上述选择结果，取一定量抗血清与一定量融化并冷却至56℃的1.5%巴比妥缓冲琼脂混合，使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度，浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为1～2mm，玻板大小可根据实验所需而确定。如用5×7.5cm大小玻板时，约需抗血清琼脂6ml.

4、打孔、加样

待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm.于各孔中加入抗原液，每孔10微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。

5、电泳

将琼脂板置于电泳槽横梁上，加样端位于负极，以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液（槽内缓冲液为0.06M pH8.6巴比妥缓冲液）。接通电源，板端电压3v/cm，电流强度3mA/cm，电泳5小时。

6、结果判定（电泳结果示意图点击展开）

电泳毕，取出琼脂板，依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后，加1%鞣酸冲洗琼脂板，晾干，即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种：一是测量沉淀峰的高度（自孔中央至峰尖），以mm计；另一是以求积仪测量沉淀峰的面积，以mm2计。前者较简便，后者较准确。根据测定的结果，从标准曲线中计算出待检标本中的抗原含量。

7、标准曲线制定

用上述选择好的最适浓度抗血清制备琼脂板。打孔，加入合适比例的5～10个标准抗原浓度，反复试验10次，取每次电泳后所测定的沉淀峰高度（或面积）的平均值，绘出标准曲线。